纸层析的实验汇报
前言
纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证实 了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。
纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤
纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如三，四-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在
做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下四条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。
纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下四条色素带，所以利用纸层析法 能清楚地将叶绿体中的色素分离。
氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的.基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为二l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为一零零万吨，而需求总量是八零零万吨。我国自二零世纪六零年代起，氨基酸的应用在食品工业占六一％，在饮料工业占三零％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。
氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：
(一)在食品行业的应用
(二)在医药工业的应用
(三)在饲料添加剂行业的应用
(四)在化妆品行业的应用
(五)在农业上的应用
(六)在其他行业的应用
氨基酸工业还有着广阔的发展前景：
(一)传统的氨基酸生产方法
(二)运用基因工程手段生产氨基酸
(三)大力发展药用中间体,具体为：
①氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体
②非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料
③生产高附加值的非天然氨基酸
一、实验目的
(一)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色）。
(二)学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法。
二、实验原理
(一)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流过固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。
(二)溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示。
(三)Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。
(四)在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法
三、实验装置与试剂
(一)氨基酸标准液(一mg/ml)
亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。
(二)八零%甲醇
(三)零.一%茚三酮丙酮溶液
(四)氨基酸混合液(每种氨基酸五零零mg/mL)
(五)正丁醇
实验仪器
(一)新华滤纸×一
(二)培养皿×一
(三)电热鼓风干燥箱×一
(四)吹风机×一
(五)毛细管×四
（六）针、线、尺×一
（七）钟罩(高约四三零mm,直径约二九零mm，具磨口塞)×一
实验操作
(一)滤纸
选用国产新华 一号滤纸， 六cm×七cm。在距滤纸二cm处划线，用
铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。
（二）点样
点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在零.五cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注重温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注重缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。
(三)展层
将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注重滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约一cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。
酸溶剂系统：
正丁醇： 八零%甲酸：水=一五:三:二(体积比)，茚三酮二ml。温度二五℃，时间一h。
注重：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。
（四）显色
待展层基本结束后, 置六五℃鼓风箱中一零-二零min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。
（五）Rf值的计算
实验六 纸层析法观察转氨基作用
【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用
零九救援一班 第三大组 李岚宇 二零零九二二二三三六
室温：二八°
（一）实验目的：
一、学习氨基酸纸层析的基本原理。
二、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
（二）实验原理：
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：
α—酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证实 转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示： ALT
物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
（三）实验材料与仪器：
试剂：
一、零.零一mol/L pH 七.四磷酸盐缓冲液。
二、零.二mol/L Na二HPO四溶液八一ml与零.二mol/L NaH二PO四溶液一九ml混匀,用蒸馏水稀释二零倍。
三、零.一mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸零.八九一克,先溶于少量零.零一mol/L pH 七.四磷酸盐缓冲液中,以一.零 N NaOH仔 细调至pH七.四后, 加磷酸盐缓冲液至一零零ml。
四 、零.一mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸一.四六一克,先溶于少量零.零一mol/L pH 七.四磷酸盐缓冲液中，以一.零 N NaOH仔细调至pH 七.四 后，加磷酸盐缓冲液至一零零ml。
五、零.一mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸零.七三五克,先溶于少量零.零一mol/LpH 七.四磷酸盐缓冲液中，以一.零 N NaOH仔细调至pH 七.四 后, 加磷酸盐缓冲液至五零 ml。
六、零.五%茚三酮溶液称取茚三酮零.五克于一零零 ml丙酮中溶解。
七、层析溶剂：将重蒸过的酚二份和水一份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置二四小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。
仪器：玻璃匀浆器、一零ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、三七℃恒温水浴箱、九cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。
（四）实验步骤:
一、肝匀浆制备：取新鲜动物肝零.五克,剪碎后放入匀浆器,加入冷零.零一mol/LpH 七.四磷酸盐缓冲液一.零 ml,迅速研成匀浆， 用上述缓冲液四.五ml混匀备用。
二、 酶促反应过程
（一）取离心管两支，编号：一（测定管）、二（对照管），各加肝匀浆零. 五ml。把对照管放沸水浴中加热一零分钟，取出冷却。
（二）各加零.一mol/L丙氨酸零.五 ml, 零.一mol/Lα-酮戊二酸零.五 ml,零.零一mol/L pH 七.四磷酸盐缓冲液一.五 ml,摇匀。
（三）三七℃保温，三零分钟后取出，保温完毕。
（四）把测定管放沸水浴中煮一零分钟，取出后冷却，过滤。
三、层析
（一）取圆形滤纸一张（直径九cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约一 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。
（二）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点二、四处。把测定液、对照液分别点在原点一、三处。注重斑点不宜过大（应在直径零.五cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第二次。
（三）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。
（四）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四面 扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约一cm时，约二五分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。
（五）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴零.五％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。
（五）实验结果记录：
（六）实验讨论：
一、从表格（一）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。
二、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。
三、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注重安全，防止溅到皮肤及眼睛。
四、点样点不宜过大，直径小于零.五cm.
二零一零年九月一九日
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